¿DÓNDE Y CUÁNDO SE REPLICA EL ADN?

La duplicación o replicación del ADN es el proceso mediante el que se sintetiza, a partir de una molécula de ADN, dos nuevas moléculas de ADN hijas con la misma secuencia de nucleótidos que la del ADN original. La replicación tiene lugar en el núcleo durante la fase S de la interfase del ciclo celular.

¿CÓMO SE ORIGINAN LAS NUEVAS CADENAS DE ADN?

Meselson y Stahl realizaron el siguiente experimento:

• CRECIMIENTO EN N¹⁵: Hicieron crecer bacterias (Escherichia coli) en un medio con nitrógeno pesado, N¹⁵. El N¹⁵ es un isótopo del nitrógeno más pesado que el habitual, el N¹⁴.
• CRECIMIENTO EN N¹⁴: Después, pasaron las bacterias a un medio con N¹⁴, más ligero, donde continuaron su crecimiento.
• CENTRIFUGACIÓN: Como las moléculas de ADN sintetizadas con N¹⁵ pesan más que las de N¹⁴, se pueden separar mediante centrifugación, ya que las moléculas de ADN menos pesado quedan más arriba y las de ADN más pesado quedan más abajo.
• RESULTADOS:
  • En la primera generación de bacterias, se obtuvo una única banda de ADN con densidad intermedia.
  • En la segunda generación se obtuvieron 2 bandas, una con densidad ligera y otra con densidad intermedia o híbrida.
  • En la tercera generación se obtuvieron 2 bandas, una ligera (con una abundancia del 75 %) y otra intermedia (con el 25 % restante).

• CONCLUSIÓN: La banda intermedia o híbrida representa una molécula de ADN que contiene una cadena pesada (original, con N¹⁵) y otra ligera (recién sintetizada, con N¹⁴). Las cadenas ligeras representan una molécula de ADN en la que las dos cadenas han sido sintetizadas (no existían aún cuando las células se pusieron en presencia de N¹⁵).

El hecho de que cada vez haya más moléculas ligeras y se mantenga el número de moléculas intermedias demuestra que la replicación del ADN es SEMICONSERVATIVA. Si fuera conservadora, aparecería siempre una banda pesada y el resto. Si fuera dispersiva sólo aparecerían bandas híbridas de densidad intermedia en todas las generaciones.

¿QUÉ NECESITAMOS PARA REPLICAR ADN?

Kornberg, discípulo del bioquímico Severo Ochoa, aisló la enzima ADN-polimerasa a partir de la bacteria Escherichia coli, y comprobó que es capaz de sintetizar ADN in vitro. La ADN-polimerasa necesita :

• desoxirribonucleótidos-5-trifosfato de adenina, timina, guanina y citosina, 
• iones magnesio Mg²⁺
• ADN molde que haga de “patrón”
• un fragmento de ARN que actúe como “cebador” o «primer». Este fragmento lo forma una ARN polimerasa. Una vez iniciada la síntesis la propia cadena cadena de ADN sintetizada actúa como cebador.

La ADN-polimerasa es una enzima formada por unos 1000 aminoácidos, y se localiza en el núcleo y en las mitocondrias. y los cloroplastos. A esta enzima se une el ADN patrón, el ADN cebador, y el nucleótido que se va a añadir. Puede sintetizar in vitro (no en una célula viva) ADN a partir de ADN natural.

La ADN-polimerasa no puede comenzar la síntesis de una cadena, sino que únicamente puede añadir nucleótidos al extremo de una cadena preexistente, el  cebador. Sólo añade los nucleótidos en el extremo de la cadena que presenta libre el carbono 3’ del nucleótido.

¿EN QUÉ SENTIDO CRECEN LAS CADENAS DE ADN?

De este modo, la cadena que comienza su síntesis, sólo crece en el sentido 5’→3′. Así, el nucleótido que tiene su carbono 5′ libre es el primer nucleótido de la cadena de ADN y el nucleótido que tiene libre el carbono 3′ es el último nucleótido que se ha añadido a la cadena, y al que se puede añadir otro. La nueva cadena sintetizada es antiparalela y complementaria.

¿CÓMO ES POSIBLE LA SÍNTESIS 5’→3′ EN LAS 2 CADENAS SI LA ADN polimerasa AVANZA EN UN SENTIDO?

Cairns, en 1963, realizó uno de los primeros experimentos que trataban de observar cómo se desarrollaba la replicación del ADN.

Introdujo bacterias Escherichia coli en un medio con timina marcada con tritio (H³), es decir, una timina que en vez de hidrógeno tenía tritio. El tritio es un isótopo radiactivo que emite partículas beta (β) que pueden ser detectadas en una placa fotográfica, lo que permite localizar las nuevas moléculas de ADN que se han sintetizado. Cada pocos minutos se comprobaba la cantidad de timina (con H³) que contenía el ADN bacteriano, obteniéndose una secuencia de imágenes con la duplicación completa del ADN.

• Las primeras imágenes tenían forma de V, las siguientes de medias lunas, y las últimas parecían círculos más o menos aplastados.
• Las formas en V son las horquillas de replicación, formadas por las dos nuevas cadenas de ADN (con H³) que se sintetizan sobre las cadenas de ADN que se han abierto para hacer de moldes.
• Las formas en media luna corresponden a las burbujas de replicación.

De las imágenes se dedujo lo siguiente:

• El ADN de la bacteria Escherichia coli era circular.
• Se confirmó la hipótesis semiconservativa de la replicación del ADN y también se descubrió que la replicación del ADN se producía a partir de un punto concreto y que la replicación era bidireccional, habiendo una horquilla a la izquierda del punto de inicio y otra horquilla a la derecha, que van progresando en direcciones opuestas.

Si una cadena crecía en dirección 5’→3′, la otra lo tendría que hacerlo en dirección 3’→5′, lo que es imposible de explicar, ya que ninguna ADN-polimerasa añade nucleótidos en esa dirección.

La respuesta a estos dilemas la dio Okazaki en 1968. Descubrió que había unos fragmentos formados por unos 50 nucleótidos de ARN y unos 1000 ó 2000 nucleótidos de ADN, llamados fragmentos de Okazaki. Estaban sintetizados por la ARN-polimerasa, que no necesita ningún cebador para comenzar, y luego por la ADN-polimerasa, que añadía los nucleótidos en dirección 5’→3′ sobre la hebra patrón. Después se pierde el trozo de ARN y se fusionan el resto de fragmentos, dando la sensación de que hebra crece en dirección 3’→5′.